目的:构建缝隙连接蛋白connexin 43（CX43）特异性shRNA重组腺病毒载体,为应用基因沉默技术从转录后水平进行基因治疗研究奠定基础。方法:合成CX43发夹样shRNA的DNA单链一对和对照单链scramble一对,退火后将其克隆至带有增强型绿色荧光蛋白（eGFP）报告基因的穿梭质粒pAd shRNA/H1,得到pAd shRNA/H1-CX43和pAd shRNA/H1-scramble。分别酶切及DNA测序鉴定后,经Pme I线性化后转化入BJ5187-AD-1感受态细菌,在细菌内进行同源重组构建含目的基因的重组腺病毒质粒载体。用Pac I酶切鉴定重组菌。将Pac I酶切重组的两种腺病毒质粒载体后,经脂质体转化293细胞进行包装得到重组的腺病毒颗粒,并通过293细胞绿色荧光表达反应重组腺病毒表达情况。将重组的腺病毒Ad-Cx43 shRNA和对照病毒Ad-scramble shRNA分别感染大鼠原代培养的星形胶质细胞,并检测星形胶质细胞CX43的表达。结果:证实穿梭质粒的以及重组腺病毒质粒均构建正确,腺病毒质粒转染293细胞后48 h即可见绿色荧光蛋白表达,10 d后全部细胞表达绿色荧光,并有半数细胞飘起,收获病毒感染培养星形胶质细胞后48 h,均有绿色荧光表达,经感染Ad-Cx43 shRNA的星形胶质细胞CX43的表达明显低于感染对照病毒Ad-scramble shRNA的星形胶质细胞。结论:成功构建表达大鼠CX43特异性发夹状shRNA的重组腺病毒载体,将为应用基因沉默技术研究CX43在神经系统疾病尤其是缺血性脑损伤中的作用提供依据。