目的建立HPLC-MS/MS法同时测定体外培育牛黄Calculus Bovis Sativus（CBS）和天然牛黄Calculus Bovis（CB）中26种胆汁酸成分。方法 Symmetry C18色谱柱（150 mm×2.1 mm,3.5μm）,流动相为水（0.1%甲酸+10 mmol/L乙酸铵）-甲醇（0.1%甲酸+10 mmol/L乙酸铵）,体积流量0.15 m L/min,梯度洗脱,进样量为10μL。质谱采用电喷雾离子源,负离子模式监测,喷射电压-4 500 V,离子源温度350℃,采用多反应监测模式（MRM）。结果牛黄中26种胆汁酸在线性范围内峰面积与摩尔浓度均呈良好的线性关系（r≥0.991 4）,加样回收率为98.2%102.3%,精密度RSD值小于0.95%,CBS和CB的胆汁酸类成分在种类和含量上存在一定差异。结论该法灵敏度高、专属性好、结果可靠,适用于牛黄中胆汁酸成分的测定。