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华中科技大学同济医学院附属同济医院
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摘要：
本发明公开了一种使用人多潜能干细胞诱导获得脊髓谷氨酸能中间神经元的方法及其应用，涉及多潜能干细胞分化诱导技术领域。本发明采用多组不同的小分子组合物，对人多潜能干细胞进行多个阶段的诱导分化，获得脊髓p3前体细胞，并通过成熟培养最终获得脊髓V3谷氨酸能中间神经元。采用本发明的这种方法，能够获得更高纯度的脊髓V3谷氨酸能中间神经元。
主权项：
1.使用人多潜能干细胞诱导获得脊髓谷氨酸能中间神经元的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、使用人多潜能干细胞加至含有第一小分子组合物的诱导分化培养基中，诱导分化得到神经上皮细胞；所述人多潜能干细胞为H9人胚胎干细胞系；所述诱导分化培养基包括体积比为1:1的DMEM/F-12和Neurobasal，还包括体积分数1%的NEAA、体积分数1%的N-2、3μM的CHIR99021、2μM的SB431542、2μM的DMH1混合配制而成；所述第一小分子组合物为CHIR99021、SB431542、DMH1；S2、取步骤S1所得神经上皮细胞加至含有第二小分子组合物的模式化培养基中，诱导分化得到表达Nkx2.2＋/Hoxb4＋的脊髓p3前体细胞；所述模式化培养基包括体积比为1:1的DMEM/F-12和Neurobasal，还包括体积分数1%的NEAA、体积分数1%的N-2、体积分数2%的B27、2μM的DMH1、2μM的SB431542、0.1μM的RA、2.5μM的IWR-1、2μM的IWP-2和1μM的SAG混合配制而成；所述第二小分子组合物为DMH1、SB431542、RA、IWR-1、IWP-2和SAG；S3、取步骤S2所得表达Nkx2.2＋/Hoxb4＋的脊髓p3前体细胞加至含有第三小分子组合物的维持模式化培养基中悬浮培养，诱导分化得到表达Nkx2.2＋/Neurog3＋的脊髓p3前体细胞；所述维持模式化培养基包括体积比为1:1的DMEM/F-12和Neurobasal，还包括体积分数1%的NEAA、体积分数1%的N-2、体积分数2%的B27、0.1μM的RA、0.5μM的SAG混合配制而成；所述第三小分子组合物为RA和SAG；S4、取步骤S3所得表达Nkx2.2＋/Neurog3＋的脊髓p3前体细胞，在Matrigel或PLO/Laminin处理的玻片上贴壁培养1-3周，进行神经营养使其成熟得到表达Sim1＋/vGluT2＋的脊髓V3谷氨酸能中间神经元；神经营养所用的培养基的组分包括Neurobasal，还包括体积分数1%的NEAA、体积分数1%的N-2、体积分数2%的B27、1μM的AA、1μM的cAMP、10ng/mL的BDNF和10ng/mL的GDNF。
