摘要：
目的通过CRISPR/Cas9技术敲除人腹膜间皮细胞系HMrSV5的PKCα基因,为腹膜纤维化的发病机制研究提供体外细胞模型。方法针对人PKCα基因外显子区域设计3对sgRNA序列,其中两对序列靶点位于第4外显子,一对序列靶点位于第3外显子。由引物合成公司合成两端含酶切位点黏端的寡聚双链DNA,酶切连接至真核表达载体GV393。使用293T细胞进行慢病毒包装,通过病毒感染HMrSV5细胞,检测HMrSV5细胞中PKCα的敲除效率即脱靶情况。结果 3对sgRNA通过慢病毒表达载体成功转染HMrSV5细胞,经实时荧光定量PCR及免疫印迹检测两对sgRNA成功敲低PKCα。错配酶和基因测序结果显示PKCα基因组DNA导入有效突变,3个脱靶位点与原参考序列一致,排除脱靶情况。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建了PKCα敲除的HMrSV5细胞,有利于相关基因体外研究。
