目的应用无血清培养基分离胰腺癌干细胞,检测其miR-590-3p的表达。方法运用无血清培养基克隆培养ASPC-1、PANC1细胞,检测其单克隆形成、分化及细胞周期、半数抑制浓度(IC50)和表面标记物CD24+、CD44+表达。实时定量PCR法检测细胞miR-590-3p的表达。结果经无血清培养基培养,（0.94±0.53）%的ASPC-1细胞和（0.57±0.12）%的PANC1细胞能存活,呈克隆球样悬浮生长,并可以在体外连续传代。加入血清后细胞球又重新贴壁生长。ASPC-1细胞球G0/G1期比例和CD24+、CD44+、CD24+CD44+的细胞比例及IC50分别为（75.3±5.4）%、0.96%～2.01%、27.52%～34.47%、0.35%～0.44%和（224.37±5.71）μg/ml,均显著高于亲本细胞的（43.7±3.8）%、0.38%～0.42%、17.65%～18.25%、0.05%～0.08%、（11.43±2.10）μg/ml（P值均(0.05）。PANC1细胞球G0/G1期比例和CD24+、CD44+、CD24+CD44+的细胞比例及IC50分别为（80.1±4.7）%、5.31%～9.84%、72.05%～93.06%、4.91%～5.21%、（296.58±4.27）μg/ml,均显著高于亲本细胞的（46.1±5.3）%、4.09%～4.97%、47.71%～55.66%、1.48%～2.63%、（26.17±3.81）μg/ml（P值均(0.05）。ASPC-1、PANC1细胞球miR-590-3p表达分别是亲本细胞的4.67和4.52倍。结论应用无血清培养基可以从ASPC-1、PANC1细胞系中分离出具有干细胞特性的胰腺癌细胞球,其miR-590-3p表达上调,该基因可能是胰腺癌干细胞特性维持的关键基因。